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怎样克隆启动子和测定其序列?步骤尽量说详细点

2024-10-29 11:28:21 编辑:join 浏览量:547

怎样克隆启动子和测定其序列?步骤尽量说详细点

如果基因组测序已经完成的话,直接可以看出来,如1L说的,设计引物,PCR就可以;

如果是基因组没有完成测序,要去克隆一个已知基因的启动子:

首先,你需要自己做一个genomic walking的模板(基本原理为:抽提该物种的DNA,DNA的质量必须保证无杂质,纯度、浓度高;根据物种的不同,分别用3-5种限制性内切酶酶切DNA,酶切过后加相应的接头,平末端链接,这样一套模板就算完成,理论上该模板时一段段被切开的DNA序列,并且两端带有了特定的接头-clontech公司试剂盒);

设计引物,在目的基因的5‘UTR设计一对往上游扩增的槽式引物(GC含量、Tm值尽量高,66度往上);

PCR克隆,根据自己合成的槽式引物和genomic walking的模板末端加上的接头序列,PCR(一般都是用Touch DownPCR,根据槽式引物,扩增两轮,第二轮是以第一轮的PCR产物为模板);

点样检测,挖胶回收特异的条带;

TA克隆,选择阳性克隆测序。

一般启动子的长度超过1K就可以了。一次长度不够,可以根据测出来的序列再次设计引物往上游扩增。

启动子区序列都有的,测它干嘛。

克隆的话,设计引物,pcr就是了

标签:启动子,克隆

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